背景介紹:一氧化二氮(N2O)是一種重要的臭氧消耗物質和強大的溫室氣體，其效力大約是CO 2的265倍。在過去的三十年中，大氣N2O濃度以每年0.73 ppb的速度逐漸增加。盡管N2O排放主要來自農業活動，但應密切監測污水處理廠的貢獻N2O是在污水處理廠的生物脫氮過程中產生的，例如來自氨氧化、硝化器反硝化和不完全異養反硝化。外部添加的作為電子供體的碳源，例如乙醇、甲醇和醋酸鹽，控制著在反硝化生物反應器中的反硝化性能和N2O排放量。盡管實際實施了異養反硝化細菌的外部碳供應，但尚未系統地研究它們的N2O消耗動力學和不同碳源的性能。因此，有必要進一步探索各種碳源對作為反硝化最后一步的N2O消耗的生物動力學的影響。本研究調查了不同有機碳源對經典反硝化進化枝I和進化枝II型N2O還原細菌N2O消耗生物動力學的影響。鑒于有機碳源的可用性是主要決定N2O消耗潛力的因素之一。研究人員假設有機電子供體可能是控制(1)N2O相關生物動力學和(2)N2O消耗活動的彈性的因素之一在不同的N2O還原劑中以不同的方式暴露于氧氣中，這取決于它們包含的能量代謝相關基因組。為了驗證這些假設，研究人員使用微呼吸系統對N2O進行了在線監測，在有氧間隔和無氧間隔的缺氧條件下培養的微生物培養物中的N2O和溶解氧(DO)濃度。


Unisense微電極系統的應用


建立了用于同時監測氧氣和N 2 O的微呼吸測量系統，以檢查不同有機碳源對N2O還原菌生物動力學的影響。細胞培養物在可容納兩個微電極和攪拌棒（Unisense）的H型瓶（有效體積為10 mL）中孵育。每種細菌進行五批測試，每批測試都有不同的碳源，即乙酸鹽、琥珀酸鹽、甘油、甲醇或乙醇。在每批試驗開始時，將10 mL細胞懸液移入的H形微呼吸小瓶，微呼吸瓶中裝有氧氣和N2O微呼吸電極（Unisense，Aarhus，Denmark），在小瓶中沒有頂部空間。隨后，將20μL的濃縮N 2 O溶液（25°C下為24 mM）注入小瓶中，以達到大約50μmol L-1的初始N2O濃度。如下添加碳源和電子源：乙酸鹽（320μmol L-1）、甲醇（420μmol L-1）、乙醇（210μmol L-1）、甘油（180μmol L-1）或琥珀酸酯（180μmol L-1)。過量添加有機化合物以確保N2O還原活性不受電子供體短缺的限制。微呼吸系統在保持在30±0.2°C的水浴中運行，以便與之前在相同溫度下進行的結果進行比較，并以500 rpm的速度攪拌。使用Sensor Trace Suite軟件(Unisense)處理N2O和氧氣測量值。DO濃度與N 2 O濃度一起監測，因為它是影響N 2 O消耗活動的關鍵因素。


實驗結果


本研究系統地比較了四種N2O還原菌在5種不同碳源下的N2O消耗和N2O回收情況。當N2O作為唯一的電子受體時，有機碳源顯著影響了異養型N2O還原菌的生產性能、生物動力學和生物量產量。在碳源中，乙酸和琥珀酸對DO和N2O的消耗率最高，且進化支II型Azospira spI13的消耗率高于進化支I型Ps.stuzeri和Pa.denitrificans。由好氧向缺氧過渡后的N2OR恢復力主要依賴于N2O還原菌的類型和補充的碳源。當添加乙酸和琥珀酸時，II型nosZ菌的生物量比I型nosZ菌高。

圖1、微呼吸系統示意圖，建立了用于同時監測DO和N 2 O的微呼吸測量系統，以檢查不同有機碳源對N 2 O還原菌生物動力學的影響。

圖2、反硝化細菌（進化枝I）、施式假單胞菌（進化枝I）、固氮羅菌株I09（進化枝II）和固氮羅菌株I13（進化枝II）中N 2 O（紅色）和氧氣（藍色）濃度分布的動態變化。使用乙酸鹽(a)、琥珀酸鹽(b)、甘油(c)、乙醇(d)和甲醇(e)作為碳源。體系中N2O注射用黑色垂直箭頭表示。圖中顯示了代表性的N 2 O和DO濃度分布。

圖3、以乙酸、琥珀酸、甘油、乙醇和甲醇為碳源對應的反硝化細菌(clade I)、施式假單胞菌（cladeⅡ）/固氮羅菌屬I09（cladeⅡ）、固氮羅菌屬I13（cladeⅡ）的氧氣消耗率的全細胞Michaelis-Menten曲線。這些數據是從三次試驗中獲得的。

圖4、以乙酸、琥珀酸、甘油、乙醇和甲醇為碳源對應的反硝化細菌(clade I)、施式假單胞菌（cladeⅡ）/固氮羅菌屬I09（cladeⅡ）、固氮羅菌屬I13（cladeⅡ）的氧化亞氮的消耗率的全細胞Michaelis-Menten曲線。這些數據是從三次試驗中獲得的。

圖5、缺氧條件下N2O還原活性的恢復。橫軸表示DO耗盡后的時間。數據點來自三次N2O呼吸試驗。實線表示各碳源N2O還原恢復的線性模型，虛線表示95%置信區間。


結論與展望


利用一氧化二氮(N2O)還原細菌是減少工程系統的N2O足跡的一種很有前景的策略。使用優選的有機碳源作為電子供體可加速這些細菌對N2O的消耗。然而當喂食不同的有機碳物種時，它們的N2O消耗潛力和活性仍不清楚。本論文研究人員通過研究它們的生物動力學特性和基因組潛力，系統地比較了各種有機碳源對N2O還原細菌活性的影響。五種有機碳源——乙酸鹽、琥珀酸鹽、甘油、乙醇和甲醇被送入四個含有進化枝I或進化枝II nosZ基因的N2O還原細菌。使用Unisense微呼吸系統對四種N2O還原細菌菌株進行了呼吸測定分析，確定了響應于不同喂養方案的溶氧和N2O消耗生物動力學的不同變化。不管N2O還原菌是什么，使用乙酸鹽和琥珀酸鹽都獲得了更高的N2O消耗率和更高的生物質產量。通過基因組分析研究了代謝補充碳源的潛力，其結果證實了N2O消耗生物動力學結果。此外，電子供體的選擇對N 2O消耗活動在氧氣暴露后恢復。本研究的結果有助于為污水處理廠異養反硝化過程中產生和排放的N 2 O制定有效的緩解策略