1 植物群體遺傳蛋白質組學


1.1遺傳多樣性蛋白質研究


基于基因組學的一些遺傳標記，如RAPD(Random Amplified Polymorphic DNA)、RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism)、SSR(Simple Sequence Repeat)、ISSR(Inter-Simple Sequence Repeat)等，已經廣泛地應用于植物遺傳研究中。


與基因組學的遺傳標記相比，由于蛋白質組學的研究對象是基因表達的產物，是介于基因型和表型之間的特性，因而蛋白質組學標記是聯系基因多樣性和表型多樣性的紐帶，具有獨特的意義。


通過蛋白質組比較來檢測遺傳多樣性的變化已有許多成功的嘗試。Barrenche等(1996年)比較了6個歐洲國家的23種橡樹，分析了幼苗的總蛋白質，共得到530種蛋白質，其中101個具有多態性。


實驗結果顯示種內和種間的距離非常接近，并且證實無?；?Quercus petraea)和夏櫟(Quercus robar)兩個種的遺傳分化水平很低。Picard等(1997年)利用2D-PAGE分析了親緣關系很近的硬粒小麥不同株系的遺傳多樣性，發現品系間的多態性很低并且7個蛋白可以用于基因型的鑒定。


David等(1997等)也利用2D-PAGE技術比較了栽培于不同環境下但起源于同一種群的小麥，結果所有的種群都與原種群有差別，David等認為，這不是由隨機漂移引起，而是由適應其各自的氣候條件而形成。


1.2 突變體的蛋白質組學研究


突變體研究是植物遺傳學的重要研究手段之一，應用蛋白質組學的方法對基因突變引起的蛋白質表達變化進行研究可以揭示一些植物生理生態過程的機制。具體做法通常是對在相同條件下栽培的突變體及野生型植物的2D-PAGE圖譜進行比較，受到影響的蛋白質通過質譜法或Edman測序法進行鑒定，為研究表型突變背后的生化過程提供有價值的信息。


Santoni等(1994年)對模式植物擬南芥發育突變體的總蛋白質進行了分析，結果顯示突變體具有與野生型植物不同的獨特的2D-PAGE圖譜，并且得到了與下胚軸長度有關的一個肌動蛋白的同源異構體。


Herbik等(1996年)分析了野生型和缺鐵突變體番茄(Lycopersicon esculentum)的蛋白質2D-PAGE圖譜，鑒定了參與無氧代謝和脅迫防御的幾種酶，如甘油醛-3-磷酸脫氫酶、甲酸脫氫酶、抗壞血酸過氧化物酶、超氧化物歧化酶、質體藍素等，并分析了這些酶在獲得鐵的過程中的功能。


von Wiren等(1997年)比較了野生型和鐵攝取缺陷型突變體玉米的蛋白質2D-PAGE圖譜，確定了4個與鐵離子跨膜運輸有關的多肽。


Komatsu等(1999年)比較了水稻綠苗和白化苗的蛋白質2D-PAGE圖譜，發現了在綠苗中參與光合作用的蛋白質，而白化苗中僅有此蛋白質前體。而抗壞血酸過氧化物酶只在白化苗中存在，說明抗氧化酶在白化苗中起細胞保護功能。


當已知突變的基因時，可用蛋白質組學技術研究受此基因控制的有關信息。玉米中的Opaque 2(O2)基因編碼一個屬于亮氨酸拉鏈家族的轉錄因子，這個轉錄因子對蛋白質的表達有多種效應。


Damerval和Le Guillonx(1998年)將野生型與O2基因突變體的蛋白質2D-PAGE圖譜進行比較，鑒定出屬于各種代謝途徑的一些酶，說明O2基因是玉米代謝中聯系多種代謝途徑的調節基因。這些結果表明，單一位點的突變可以引起蛋白質表達的多種效應，而用蛋白質組學技術可以看到這些效應。


2 植物環境信號應答和適應機制蛋白質組學


2.1 非生物環境因子蛋白質組學研究


在植物的生存環境中，一些非生物因子脅迫，如干旱、鹽漬、寒害、臭氧、缺氧、機械損傷等，對植物的生長發育和生存都會產生嚴重影響。這些脅迫可以引起大量的蛋白質在種類和表達量上的變化，而蛋白質組學研究可以使我們更好地了解非生物脅迫的傷害機制以及植物對非生物環境的適應機制。


Salekdeh等(2002年)研究兩個水稻品種(Oryza sativa L. cv CT9993 和 cv IR62266)干旱脅迫下以及恢復灌溉后的蛋白質組。分析葉提取物電泳膠上的1000多個蛋白點，發現有42個蛋白點的豐度在干旱脅迫狀態下變化明顯，其中27個點在兩個品種中顯示了不同的反應方式。


恢復正常灌溉10天以后，所有蛋白的豐度完全或是在很大程度上恢復成與對照一樣。Costa等(1998年)發現海岸松(Pinus pinaster)中38個受干旱影響的蛋白質，其中24個由干旱誘導，并且不同基因型對干旱脅迫的反應差別很大。


Ramani和APte(1997年)用放射性同位素自顯影雙向電泳法研究水稻幼苗鹽脅迫下多基因的瞬時表達表明，至少有35個蛋白質被鹽脅迫誘導和17個蛋白質被抑制，包括20個在這之前未曾報道的低豐度蛋白。這些發現對尋找滲透壓應答新基因，尤其是那些在水稻鹽耐性獲得中起瞬時調節作用的基因十分重要。


Agrawal等(2002年)用2D-PAGE、氨基酸測序和免疫雜交法，首次檢測了臭氧對水稻幼苗蛋白的影響。臭氧對葉片強烈的可見壞死傷害和隨之而來的抗壞血酸過氧化物酶蛋白的增加，反映在二維電泳膠上蛋白質點分布的變化。


在被檢測的具有可重復結果的56個蛋白中，52個蛋白點隨控制條件的不同發生的變化可以通過肉眼判定。檢測的56個蛋白中，6個蛋白是N-端阻斷，14個蛋白的序列無法測定，36個蛋白的N-端序列和一個蛋白的內部序列被測定。研究發現臭氧造成葉片光合蛋白的劇烈減少(包括核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶)和各種防御、脅迫相關蛋白的表達。


Shen等(2003年)應用蛋白質組學方法研究水稻葉鞘傷害反應相關蛋白，首次揭示了水稻葉鞘傷害信號應答過程中蛋白質的變化。比較傷害前后蛋白質表達譜，發現傷害后至少有10個蛋白被誘導或上調，19個蛋白被抑制或表達量下降。


通過N-端或內部氨基酸測序，分析了其中的14個蛋白，鑒定了9個蛋白的功能，其它蛋白由于N-端阻斷，無法得到氨基酸序列信息。此外，還通過MALDI-TOF-MS測定了11種蛋白質，并與水稻數據庫相吻合。


在基因功能被確認的蛋白質中，表達量下降的蛋白有2個鈣網蛋白、組蛋白H1和血紅蛋白和一種假定的過氧化物酶；表達量增加的蛋白包括胰蛋白酶抑制因子(BBT1)、兩種假定的蛋白激酶受體類似物、鈣調素相關蛋白、核酮糖-l,5-二磷酸羧化酶／加氧酶小亞基、2個甘露糖結合外源凝集素。


其中，4種蛋白質已被證實為與傷害反應直接作用的蛋白質。


Chang等(2000年)對玉米進行缺氧和低氧脅迫研究，發現低氧處理的效應不僅僅是缺氧脅迫誘導的糖酵解酶的增加。通過質譜法共鑒定了46個蛋白質，均為在植物中首次得到鑒定。


2.2 生物環境因子蛋白質組研究


植物的生長發育不僅與非生物因子密切相關，還受到生物因子如動物、植物、微生物等的極大影響。例如，當植物受到競爭、動物取食、微生物共生或寄生、病菌侵害時，植物將改變體內蛋白質的表達和酶類的活性等來完成這些信號的感應、傳遞以及生物學效應的實現。


因此，通過對蛋白質的研究有助于人們更好地了解生物之間的相互作用機制。目前關于非生物因子對植物影響的蛋白質組學研究主要集中在植物與根瘤菌以及植物與菌根真菌的共生關系上。


眾所周知，根瘤菌與植物相互識別后，進入植物細胞內變成具有因氮能力的類菌體。類菌體周隙(PS，Peribacteroid space)是類菌體周膜(Peribacteroid membrance,PBM)與細菌質膜之間的間隙，是共生體成員之間交換代謝產物的媒介。


Saalbach等(2002年)用蛋白質組分析的方法，鑒定了PBM與PS中的蛋白。結果表明PS甚至PBM的制備物中含有大量的類菌體蛋白。有趣的是，除了一些PS/PBM蛋白，還有許多內膜蛋白，包括V-ATPase，BIP和一個完整的COPI-coated vesicles的膜蛋白存在于PRM中，這證明了PBM是由宿主細胞的內膜系統產生的。


Wienkoop和Saalbach(2003年)選取豆科模式植物日本百脈根(Lotus japonicus)，用蛋白質組學的手段研究PBM的蛋白質組。通過納米液相色譜分離多肽，然后用串聯質譜(MS/MS)進行分析。


檢索非豐度蛋白數據庫和通過串聯質譜得到的綠色植物表達序列標簽數據庫，鑒定了大約94個蛋白，遠遠多于迄今為止所報道的PBM蛋白的數目。


特別是一些膜蛋白得到檢測，如糖和硫酸鹽轉運子、內膜聯合蛋白(如GIP結合蛋白)和囊泡受體、信號相關蛋白(如受體激酶、Calmodulin、14-3-3蛋白和病原體應答蛋白包括HIR蛋白)。通過非變性凝膠電泳分析了兩個特征蛋白復合物。結果鑒定了PBM中參與特定生理過程的蛋白和結瘤特異表達序列標簽數據庫(EST)中的PBM蛋白質組。


Bestel-Corre等(2002年)用雙向凝膠電泳和銀染分析接種灌木菌根真菌(Glomus mosseae)或根瘤菌(Sinorhizobiurn meliloti)的模式植物苜蓿不同時期的根蛋白質組。MALDI-TOF-MS分析胰蛋白酶消化的蛋白質組，在結瘤的根中鑒定到了苜蓿的一個豆血紅蛋白。內部測序、四極質譜分析和數據搜尋證明了先前預測的由菌共生體誘發表達的蛋白。


2.3 植物激素蛋白質組學研究


激素在植物一生中起著重要的調控作用，研究植物激素的信號傳導和作用機理是蛋白質組學的重要組成部分之一。


Moons等(1997年)鑒定了水稻根中3個受ABA誘導的蛋白質，其氨基酸序列測定確定其中2個屬于胚胎后期豐富蛋白(LEA)的2組和3組，第三個未知。


用ABA處理水稻根并提取其mRNA，構建cDNA文庫，然后用由氨基酸序列推導出的寡核苷酸做探針進行篩選，分離到了相關的cDNA，但在cDNA數據庫中找不到與之相同的序列。通過在基因組DNA文庫中篩選及免疫雜交分析，表明這是一個新的基因家族，編碼高度親水具有雙重結構域的蛋白質，并被ABA誘導在不同組織中表達。


Rey等(1998年)在馬鈴薯的葉綠體中發現了一個受干旱誘導的蛋白質，沒有已知的蛋白質與之相同。利用N-端序列制備的血清在葉子cDNA表達文庫中篩選，分離到了新的具有典型硫氧還蛋白特征的cDNA序列，并被硫氧還蛋白活性的生化實驗所證實。


蛋白質組學技術不僅可鑒定早就已知的典型的受環境脅迫誘導的蛋白質，如LEA蛋白質(Riccardi等，1998年)，脫水素(Dehydrin)(Moons等，1997年)，還鑒定了其它一些蛋白質。


如對脅迫引起的損害起保護作用的蛋白酶抑制劑、熱激蛋白HSP和與氧化脅迫有關的酶、參與糖酵解、木質素合成的酶等(Costa等，1998年；Riccardi等，1998年；Rey等，1998年；Pruvot等，1996年)。用赤霉素和茉莉酸處理水稻的蛋白質組變化也進行了研究。


Shen和Komatsu(2003年)將水稻葉鞘用5μmol·L-1赤霉素處理不同時間后的蛋白經2D-PAGE分離和計算機圖像分析，看到33個蛋白發生變化，其中21個蛋白點表達增強，12個蛋白表達減弱，說明赤霉素處理水稻葉鞘起碼有30多個基因的產物與之相關。


對其中的鈣網蛋白(Calreticulin)進行了深入分析，發現它有2個不同等電點(pI)蛋白點，隨赤霉素處理時間增加，pI4.0的蛋白點逐漸消失，而pI4.1蛋白點濃度則逐漸增加。由此說明鈣網蛋白在赤霉素信號傳遞調節葉鞘伸長中是一個重要組分(Shen等，2003年)。


Rakwal和Komatsu(2000年)用外源茉莉酸(Jasmonic acid)處理水稻的幼苗組織，通過2D-PAGE分析發現在水稻的莖和葉中誘導了新蛋白質。對蛋白質點進行N-端和內部測序及免疫雜交分析，發現莖中有28kD的蛋白酶抑制劑(BBPIN)和酸性的與病理有關的17kD蛋白質(PR-1)。


免疫雜交分析表明茉莉酸處理后這些蛋白質的表達具有組織特異性和發育階段特異性，說明外源茉莉酸處理可以引起與植物自我防御機制有關的基因在莖、葉組織中的特異性表達。


3 植物組織器官蛋白質組學


對于植物來說，蛋白質組學上的差異不但存在于不同基因型以及同一基因型的不同植株之間，也存在于同一植抹的不同組織和器官之間。在植物的發育過程中，不同組織和器官在功能上的分化，也表現在不同器官蛋白質的組成和數量的差異上，蛋白質組學的研究有助于我們對植物發育過程機制的理解。


關于植物組織和器官的蛋白質組學研究已經有很多報道。Tsugita等(1994年)用2D-PAGE分離了水稻根、莖、葉、種子、芽、種皮及愈傷組織等部位的蛋白質，總共得到4892個蛋白點，其中3%的蛋白質得到了鑒定。對水稻胚、胚乳、葉鞘和懸浮細胞蛋白質組學的研究也取得了進展，并且水稻的蛋白質數據庫已經建立(Komatsu等, 1993年；1999年；Zhong等,1997年；Shen等,2003年）。其它組織及器官，如擬南芥的愈傷組織和花粉，也有研究涉及(Prime等，2000年；Mayfield等，2001年）。


Blee等(2001年)研究了轉基因煙草(Nicotiana tabacum)細胞壁的蛋白質組。他們首先建立了轉入Tcyt基因的煙草懸浮培養細胞株系。該基因可使細胞產生高水平的內源細胞分裂素，從而使該細胞株系表現出細胞聚集增加、細胞變長、細胞壁加厚5倍等特征。轉化細胞壁的蛋白質組與對照煙草細胞的初生壁蛋白質組有很大差異。發現了許多初生壁中不存在的新蛋白質。已鑒定出的包括分子量為32kD的幾丁質酶、34kD的過氧化物酶、65kD的多酚氧化酶和68kD的木聚糖酶，以及一些結構蛋白質。


4 植物亞細胞蛋白質組學


植物的蛋白質組學研究目前已經深入到亞細胞水平，即研究在一個細胞器內表達的蛋白質組。研究比較多的細胞器是葉綠體。據估計高等植物大約共有約21000到25000個蛋白質(Bouchez和Hoffe，1198年)，葉綠體的蛋白質占其中10%～25%(van Wijk等，2000年），充分證明了葉綠體在植物細胞中的重要性。另外，關于線粒體與細胞壁的研究也有報道。


Peltier等(2000年)利用2D-PAGE、質譜及Edman N-端序列測定等方法，系統地分析了豌豆(Pisum sativum)葉綠體中類囊體的蛋白質，并在數據庫中進行了搜索，鑒定了61個蛋白質，其中33個蛋白質的功能及功能結構域得到了確認。Yamaguchi和Subramanian(2000年)，Yamaguchi和Subramanian(2000年)利用2D-PAGE、色譜、MS、Edman測序等多種方法鑒定了菠菜(Spinacia oleracea)葉綠體中的核糖體30S和50S亞基的蛋白質。發現菠菜的質體核糖體是由59個蛋白質組成的，其中53個與大腸桿菌有同線性，而6個是非核糖體質體特異性的蛋白質(PSRP-1到PSRP-6)。許多蛋白質表現出翻譯后的修飾。PSRP蛋白質可能參與質體中特有的翻譯及其調控過程，包括蛋白質通過質體50S亞基在類囊體膜上的定位和轉移。


利用Blue-native凝膠電泳(Peltier等,2001年)，以及MALDI-TOF和ESI-MS/MS分析，鑒定了擬南芥葉綠體中一個350kD的由10個不同的亞基組成的C1pP蛋白酶復合體，并發現了一個不屬于任何已知的葉綠體基因家族的新的葉綠體蛋白。


Vener等(2001年)利用質譜技術研究了擬南芥葉綠體中類囊體膜蛋白質的磷酸化現象。研究發現，光系統Ⅱ核心中的D1、D2、CP43蛋白質位于N-端的蘇氫酸(Thr)被磷酸化；外周蛋白PsbH的Thr-2被磷酸化；而成熟的光捕獲蛋白LCHⅡ的Thr-3被磷酸化。Vener還研究了不同生理條件下這些蛋白質的磷酸化狀態。結果表明，這些類囊體蛋白質中，沒有任何一個在穩定的連續光照條件下完全磷酸化，或者在長期黑暗適應的條件下完全去磷酸化。他們還檢測到在光/暗轉換的條件下，PsbH的Thr-4有迅速而可逆的超磷酸化現象。D1、D2、CP43蛋白受到熱激以后出現顯著的去磷酸化。光合蛋白受到熱激后磷酸化的變化比在光/暗轉換的條件下要迅速。Vener指出，質譜法為研究復雜樣品中蛋白質磷酸化的化學計量學提供了新的途徑。


Peltier等(2002年)通過蛋白質組分析法與基因組預測篩選法結合，研究擬南芥葉綠體類囊體基質蛋白質組。通過雙向電泳分離類囊體可溶蛋白質，再用質譜進行分析鑒定。鑒定了81個蛋白，用N-端測序對蛋白質的定位進行預測。通過實驗數據修正所鑒定蛋白的基因注釋，發現了一個有趣的選擇性重疊。實驗中還發現了大量同源基因的表達。研究表明基質蛋白質組的主要功能包括幫助折疊，催化類囊體蛋白的水解和抗氧化。鑒定的基質蛋白和它們的同源物的特性可以被應用于通過基因組預測基質蛋白質組。Schubert等(2002等)系統地描述了模式植物擬南芥類囊體基質蛋白的特性，證明類囊體基質有其自己特異的蛋白質組，并且鑒定了其中的36個蛋白。除了大量的肽基脯氨酸順反異構酶和蛋白酶，還發現了一些新的PsbP結構域蛋白。比較模式植物擬南芥與另一個典型的高等植物菠菜的類囊體基質蛋白質組，發現二者相似性很高。作為對本實驗的補充，Schubert等還從擬南芥整個基因組數據庫推測基質蛋白質組，估計葉綠體類囊體基質約有80個蛋白。


位于葉綠體外膜和內膜上的參與由核編碼的葉綠體蛋白質的運輸蛋白質復合體得到了詳盡的研究(May和Soll，1999年；Keegstra和C1ine，1999年)。膜上的疏水性蛋白質較多，用有機溶劑提取葉綠體蛋白和1D-PAGE分離，大約有5%～10%的膜蛋白，即15～20個蛋白質是疏水性的(Seigneurin-Berny等,1999年)。從綠藻(Chlamydomonas reinhardtii)中分離出一種含有?；惖牡兔芏热~綠體膜片段，類似于葉綠體內膜和類囊體膜。一些與葉綠體mRNA相結合的蛋白質非常富集，說明這些膜是葉綠體基因表達的場所(Zerges和Rochaix，1998年)。


蛋白質組學技術可以用于研究葉綠體蛋白質的翻譯后修飾。這方面目前已有許多報道，包括翻譯后的甲基化(對RbcS)(Grimm等，1997年)，棕櫚?；?對D1)(Mattoo和Edelman，1987年)等。但是對于翻譯后的修飾并沒有全面、系統地開展。隨著最近的2D-PAGE和質譜技術的發展和改進，這方面的研究變得更容易，這將產生許多意想不到的新發現。


蛋白質組學技術還可以對異構體基因表達及其mRNA前體的剪接、mRNA的編輯研究提供重要幫助。目前已有關于葉綠體蛋白質mRNA編輯(Sutiga和Sugiura，1996年)和剪接(Mano等，1997年)的報道。在豌豆和菠菜中已發現多基因家族(van Wijk，2000年)。這些現象當然可以通過分析mRNA或cDNA而發現，但蛋白質組學技術卻是一個強大的替代或補充方法。


Heazlewood等(2003年)用等電聚焦聚丙烯酰胺凝膠電泳、B1ue-native PAGE和反相高效液相質譜(LC/MS)的方法對純化的水稻線粒體蛋白進行分離，再用胰蛋白酶消化，然后進行串聯質譜分析(MS/MS)。查找水稻基因組的開放閱讀框架譯碼和6個表達序列標簽(EST，Expressing sequence tags)譯碼，與質譜分析所得數據進行比對，鑒定了其中149個蛋白點(91個非冗余基因的產物)，包括親水/疏水蛋白、強酸/堿性蛋白和大分子蛋白(分子量為6.7～2.52kD)的序列。確定了85個蛋白的功能，包括線粒體的許多主要的功能蛋白。Millar等(2001年)分析擬南芥組培細胞線粒體蛋白雙向凝膠電泳的結果，有大約100個高豐度蛋白和250個低豐度蛋白。用MALDI-TOF-MS分析其中170個蛋白點。查找數據庫中擬南芥基因組的編碼序列，鑒定了其中的91個蛋白。又通過序列比較鑒定了這91個蛋白中81個蛋白的功能。這些功能包括呼吸電子傳遞鏈，三羧酸循環，氨基酸代謝，蛋白質的輸入、加工與組裝，轉錄，膜轉運和抗氧化防御。Werhahn和Braun(2002年)聯合應用3種不同的凝膠電泳方法鑒定了線粒體蛋白質組的部分蛋白。首先，用藍色非變性聚丙烯酰胺凝膠電冰(B1ue-native po1yacrylamide gel electrophoresis)分離線粒體蛋白質復合體。用電洗脫法完全洗去蛋白質中的考馬斯亮藍。然后用等電聚焦，最后用十二烷基磺酸鈉(SDS)聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質復合體的亞基。該方法的可行性已通過分離ATP合酶復合體、細胞色素C還原酶復合體和線粒體外膜移位酶前體蛋白而得到驗證。利用這一方法可以分離高等真核生物中蛋白亞基的異構物。