摘要：植物在遭遇鹽堿、干旱、重金屬、低溫、酸、機械刺激等非生物脅迫時，細胞膜電化學特性的變化和調節往往是最早發生的植物細胞反應之一，并與細胞內的生理代謝活動之間存在復雜的聯系?；诖?，在過去的30年間，微電極離子流技術以其非損傷性、實時性、靈敏性和高分辨率等特有的技術優勢，成為了研究逆境脅迫條件下植物的生理響應及調節機制常用的技術手段。從跟蹤監測界面反應、解析基因功能、進行抗逆育種和研究信號物質等方面綜述該技術在植物逆境脅迫生理研究中的應用，旨在為研究植物功能基因組學和調節植物對環境的適應性提供參考。


關鍵詞：微電極離子流技術;逆境脅迫;離子流;活體;基因功能

中圖分類號：Q945.78;Q-3文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2021）01-0043-06

作者簡介：趙怡琳（1998—），女，江蘇常州人，碩士研究生，主要從事植物逆境生理研究。E-mail：1324822006 qq.com。

通信作者：汪曉麗，博士，副教授，主要從事植物營養電生理研究。E-mail：xlwang yzu.edu.cn。

非損傷微測技術（non-invasivemicro-testtechnique，NMT），別稱微電極離子流檢測（microelectrodeionfluxestimation，MIFE），最早由神經科學家Jaffe于1974年提出原初概念[1]，如今開始廣泛應用于動植物科學、微生物學、神經科學、醫學生理學、分子遺傳學等生物學領域，是近年來發展起來的可進行生理特征、生理功能動態測量的研究新手段[2]。在植物抗逆方面，NMT以其特有的優勢被眾多研究者用于干旱、高溫、低溫、鹽漬、重金屬、病原菌等非生物脅迫和生物脅迫的研究中[2]。研究受逆境脅迫后植物組織或細胞表面附近的離子流變化，對于揭示植物在遭遇逆境時的物質跨膜轉運特征、生理響應機制和調節機制都具有重要意義。


1、非損傷微測技術的原理和特點

當細胞或組織不論以主動還是被動方式吸收離子和分子時，樣品表面的離子或分子濃度會發生變化，與環境濃度形成濃度差，從而產生電化學勢梯度。非損傷微測技術通過離子/分子選擇性微電極技術，玻璃電極在臨近樣品表面的一段微小的距離內來回移動，同時測量電化學勢梯度，通過Nernst方程得到該距離內的離子或分子濃度差，并通過Fick第一擴散定律計算出流速，流速的正負符號反映了離子流或分子流移動的方向[3]。

NMT具有活體、實時、動態、直觀的優點，并可以長時間多維度地進行離子/分子流測量與掃描[3]。該技術可用于各種生物組織或細胞的研究，可單獨或同時測量H+、Ca2+、K+、NH+4、Cd2+、NO-3、O2、H2O2等離子/分子，為生物學研究提供了良好的試驗系統平臺[4]。相比于傳統的微電極技術，其優勢在于高靈敏度，兩者相差約6個數量級，而且在研究植物生理生態學過程中不須要破壞組織或細胞，能直接進行活體測定，可以實時反映進出植物體組織或細胞的離子/分子的動態變化規律。


2、非損傷技術在植物抗逆中的應用


2.1、界面反應

植物在遭遇逆境時會有一系列的生理生化反應，從而表現出各種特有的響應和調節機制。細胞膜透性和功能的改變是植物對逆境條件最為直接和快速的響應[4]，進而才是在細胞器或細胞質中進行的同化、代謝等生理過程。因此，從逆境條件下植物與外界環境之間的界面反應著眼，探索界面上特征離子或關鍵離子的流動速度和方向變化，對研究植物的逆境生理具有極為重要的意義。研究者們已對鹽漬、干旱、重金屬的脅迫方面進行了廣泛的研究，所采用的生物材料、特征離子和測定部位等列于表1。

Sa等研究了楊樹在鹽脅迫下根表NO-3和H+的凈通量，非定植根表現出較強的凈NO-3外排，而真菌定植通過降低細胞膜表面pH值和抑制H+-ATP酶活性，阻止了NO-3的損失[5]。Tang等采用NMT研究了不同NaCl濃度下小果白刺（NitrariasibiricaPall.）根幼苗分生組織中Na+、K+和H+的流速，NaCl處理后，根系穩定的K+流出量逐漸減小，并顯著增加了H+的流入[6]。Tang等研究了云杉根尖NH+4和NO-3的流速，在距離根尖13～15mm和8.0～10.5mm處檢測到NH+4和NO-3的最大凈流量，NH+4對云杉根尖吸收NO-3內流表現出明顯的抑制作用[7]。Chen等采用NMT測定大麥根部K+和Na+的流速，發現具有耐鹽性的大麥H+泵活性較高，膜電位較低，使根細胞更容易將Na+從細胞質泵入外培養基[8]。Huang等對三葉柑桔根系H2O2流速進行研究，發現菌根使主根和側根的H2O2外排量增加，從而減輕宿主植物干旱脅迫的氧化損傷[9]。Huang等使用NMT研究發現，湖北海棠（MalushupehensisRehd.）細根表面NO-3凈流入量下降，NH+4凈流入量明顯增加，說明NH+4在提高海棠耐旱性方面可能發揮著更重要的作用。在干旱脅迫下，2種銨轉運體（AMT4;2和AMT4;3）均顯著上調，而大多數與硝酸鹽吸收、還原和氮代謝相關的基因均下調。在正常氮水平下，5%聚乙二醇處理植株的生物量產量、根系生長和氮素吸收/減少值均高于低氮處理植株。這些結果表明，干旱脅迫對湖北海棠的不利影響可能隨著氮素的增加而減輕[10]。Zhang等的研究結果表明，利用聚乙二醇（PEG）模擬的干旱條件下，棉花NO-3通量由凈流入變為凈流出，在距根尖0.3cm處有1個明顯的峰值[11]。對照條件下，檉柳（Tamarixramosissima）距根尖0.3cm處未觀察到明顯的NO-3流入信號，而PEG處理顯著增強了檉柳距根尖0.3cm處NO-3的流入。Lv等首次制備了一種同時測定3種離子的氮化碳超靈敏微電極，用于測定水稻根表面不同位點Cu2+、Pb2+、Hg2+的流速[12]。Wu等研究了不同NO-3/NH+4比值對水稻根系吸收鎘（Cd）、木質部轉位以及隨后Cd積累的生理和遺傳機制，結果表明，隨著NH+4-N比例的增加，根毛區凈Cd2+流量受到抑制[13]。此外，2種劑量Cd處理下，木質部汁液中Cd濃度也呈現出隨NH+4-N比值增加而下降的趨勢。增加銨態氮營養有助于抑制水稻對Cd的吸收、木質部運輸和隨后的積累。


2.2、解析基因功能

隨著轉基因技術的發展，從植物的分子機制研究其抗逆機制也更為普遍。從分子學角度，植物抵御逆境是基因調控的結果。植物遭遇逆境時，通過啟動或關閉某些相關基因，改變生理代謝活動使植物適應逆境[13]。通過基因工程，將可能具有抗性的基因組導入擬南芥等模式植物中，研究基因組對植物抗逆的作用和機制?；蚪M學方法可以全面研究抗逆基因的功能和表達調控，并且把模式植物的抗逆信息推廣到基因組復雜的農作物上去[14]。同時可以克隆抗逆基因，在沒有抗性的植物中通過基因工程手段導入，改良作物的抗逆性[15]。

NMT在研究植物抗逆基因中的應用見表2。Fan等將海馬齒（Sesuviumportulacastrum）的SpAHA1基因轉錄入擬南芥中，使用NMT測定質膜中Na+、H+和K+的流速，結果顯示，SpAHA1蛋白在胞質膜上具有H+-ATPase的功能，SpAHA1蛋白通過增加質子的電化學梯度來降低Na+的積累，促進質膜上Na+/H+反向運輸體的交換活性，在植物抵抗鹽堿逆境中起著十分重要的作用[16]。擬南芥CYSTM3在耐鹽脅迫方面起著負調控作用是Xu等運用NMT發現的，CYSTM3基因可以抑制擬南芥根系Na+外排，抑制一系列活性氧清除酶的活性[17]。Zhang等同樣研究了轉基因擬南芥，來自胡楊的PeJRL基因在NaCl脅迫下轉基因植株保留了K+，限制了Na+的積累[18]。PeJRL轉基因株系增加了Na+的外排量，這與編碼細胞膜SOS1、AHA1和AHA2基因的上調有關。PeJRL過表達植物中活化的H+-ATPases抑制了由NaCl誘導的去極化激活的K+通道介導的損失。此外，Cd2+借用Cu2+通道、Cu2+激活Ca2+通道等，均是Cd2+吸收增加的潛在機制。Zhang等的研究表明，MhMAPK4基因過表達降低了煙草根中Cd2+的凈流入量，轉基因煙草中Cd2+流入到穩定狀態的恢復時間也比野生型煙草短，MhMAPK4過表達降低了煙草根細胞的死亡和凋亡，MhMAPK4通過調節根對Cd2+的吸收來調節Cd的積累，通過調節液泡加工酶（VPE）的活性來控制Cd引起的細胞死亡[19]。Ma等鑒定了粳稻抗寒性的數量性狀位點為COLD。過表達COLD1基因可顯著提高水稻的抗寒性，而缺乏或低表達COLD1基因的水稻對寒冷敏感。COLD1編碼定位于細胞膜，是內質網的G蛋白信號調節因子。它與G蛋白相互作用，激活Ca2+通道感知低溫，加速G蛋白GTPase活性，使水稻具有抗寒性[20]。Zhou等使用NMT分析顯示，轉基因擬南芥根在冷沖擊下Ca2+內流增加。在冷脅迫下，胞質Ca2+作為信號分子的增加激活了下游COR基因的表達。因此，Ca2+的流入可能導致轉基因擬南芥COR基因表達增加[21]。


2.3、抗逆育種

傳統方法篩選具有抗性的植物品種較為耗時費力。非損傷微測技術的活體動態測量，使試驗周期縮短，能較為快速地進行選種育種。由于不同品種的植物在逆境下的生理生化反應不同，所表現出的離子流特征也各有不同。將具有耐性的品種與沒有耐性的品種作對比試驗，了解其抗逆機制，總結具有耐性品種的離子流特征，建立抗性辨識模型。通過測定植物組織或器官具有特征性的一種或多種離子/分子流，來判斷該植物是否具有抗性，從而進行抗逆育種。

Liu等對馬鈴薯二倍體和六倍體根系K+、H+、Ca2+和Na+的凈通量進行研究，結果表明在鹽脅迫下，在根和葉組織中六倍體比二倍體保留更多的K+，積累更少的Na+。六倍體由于質膜Ca2+通道對H2O2的高敏感性，有效地將Na+區隔在伸長和成熟根區[22]。Chen等為進一步了解大麥耐鹽性性狀的遺傳行為，在6個大麥品種間進行半雙列雜交，以已知耐鹽性品種為對照，研究在鹽脅迫條件下植物根系K+損失為基礎的耐鹽性配合力。耐鹽品種CM72和Numar表現出較高的一般配合力（GCA），有較高的耐鹽性（在鹽脅迫下K+損失量較?。23]。毛桂蓮等研究灌木葉片凈Na+、K+和Ca2+流速，發現在NaHCO3脅迫下，3種灌木通過不同的策略來消除Na+毒害。寧夏枸杞葉片通過將Na+外排來降低鈉毒害，而2種濱藜是將Na+區隔化，在葉表皮形成鹽腺[24]。Zhang等測定茶樹葉片K+流速，模擬干旱脅迫誘導的茶葉細胞中K+外排與12個茶樹品種的整體耐旱性呈較強的負相關。與此相一致的是，耐旱品種葉片K+的殘留量明顯高于敏感品種。外源施用K+顯著減輕了茶樹的干旱誘導癥狀，說明K+的保留是茶樹耐旱機制的重要組成部分。藥理試驗結果表明，耐干旱和敏感茶樹品種間，K+向外整流通道和非選擇性陽離子通道對PEG誘導的葉肉細胞K+外排的控制作用是不同的[25]。


2.4、信號物質

植物感受脅迫信號，Ca2+在信號傳遞過程中發揮不可缺少的作用。Ca2+調節植物對環境脅迫的反應，在脅迫條件下，胞內Ca2+常常顯著增加，可以啟動相關基因激活一系列生化反應，使植物能夠適應環境脅迫[26]。Ca2+還能誘導相關蛋白合成，激活酶活性，參與活性氧的產生，使植物抗性增強[26]。使用非損傷微測技術檢測Ca2+流，能較為方便直觀地觀察到逆境下Ca2+流速和方向的變化，可以進一步研究Ca2+流對其他離子/分子流的影響，探究鈣信使在植物抗逆過程中起的作用。

Lang等通過研究甘草（Glycyrrhizauralensis）根部Na+和K+流速發現，鹽脅迫會提高在調節K+/Na+平衡中起信號分子作用的Ca2+、H2O2、NO、胞外ATP水平，促進Na+的外流，抑制K+的損失[27]。Chao等研究了鈾脅迫下鬼臼菌根（Syngoniumpodophyllum）根部Ca2+流速，結果表明，黑曲霉能抑制根細胞的鈣外排，從而減弱了鈾對植物生長的毒害作用[28]。在干旱脅迫下，H2S介導離子通量誘導擬南芥氣孔關閉是Jin等通過測定擬南芥葉片H+、Ca2+、K+和Cl-流速發現的，此外還發現內源性H2S在不影響H+流量的情況下，可誘導跨膜K+流出以及Ca2+、Cl-流入[29]。Rodrigo-Moreno等研究了銅脅迫下不同擬南芥根部的離子轉運情況，發現低濃度的Cu2+刺激根尖Ca2+內流，但未刺激成熟區，銅誘導K+外排并且在銅暴露后，根尖的基礎過氧化積累有所減少。銅會在胞質中產生羥自由基，從而調控細胞膜羥自由基敏感性的Ca2+和K+轉運系統[30]。


3、離子流與植物抗逆的聯系

在逆境中植物往往會受到滲透脅迫、離子失調、膜透性改變、生理代謝紊亂等危害，植物對逆境的生理方面的適應變化包括改變生物膜透性、形成逆境蛋白、產生抗氧化防御系統、進行滲透調節等[31]，其中滲透調節物質包括細胞與外界進行無機離子交換，如K+、Na+[31];細胞內合成有機物質，如脯氨酸、甜菜堿等[31]。因此在植物抗逆生理過程中進行滲透調節會伴隨著H+、Ca2+、K+、Cl-、Na+、H2O2等離子/分子流入或流出植物液泡或細胞。非損傷微測技術的試驗結果直接反映的是離子流速，從吸收或外排的離子動態變化角度可以體現植物細胞的滲透調節，表現出植物的抗逆能力。

植物抵抗鹽堿脅迫，可以通過細胞質膜上的H+-ATP酶將H+泵到胞外，形成跨膜的H+濃度梯度從而驅動Na+/H+反向運輸體將細胞內的Na+排出，同時也抑制了K+外流。Chen等對具有較強耐鹽堿脅迫能力的壇紫菜進行了研究，結果表明，與對照海草相比，壇紫菜具有較高的K+/Na+比值。壇紫菜通過Na+/H+反載體將Na+外排，同時降低了海鹽藻脫極化激活通道K+的損失，在鹽脅迫下維持Na+/H+的穩態，使壇紫菜具有抗高鹽脅迫能力[32]。Ca2+在植物干旱脅迫中，是植物細胞內重要的調節生理功能的信號物質。郎濤等研究發現，胞外ATP、H2O2、Ca2+、NO等鹽脅迫信號是通過上調紅樹根系細胞質膜Na+/H+逆向轉運體系活性，在促進Na+和H+逆向跨膜轉運的同時，抑制K+外流[33]。

植物抵抗干旱脅迫主要通過細胞進行滲透調節來保持吸水能力[34]，在根尖細胞的無機滲透調節物質，如K+、Cl-能保持滲透壓力和水分梯度，有利于細胞在干旱下維持水分。植物葉片的氣孔開閉也與K+密切相關，保衛細胞中K+外排使水勢上升，氣孔關閉，減少植物蒸騰作用。Mak等研究發現，PEG誘導的短期離子通量響應不同于植物在長期真實干旱條件下的離子通量，長期干旱導致H+流入量更小，K+和Ca2+的流出量更大[35]。聚乙二醇誘導的干旱和實際干旱條件在調節這些化學信號和膜傳輸系統方面可能是不同的。在PEG短期誘導的大豆基因表達和蛋白質組學研究中，沒有發現負責K+、H+和Ca2+通量的轉運體發生變化，說明短期脅迫時離子的流入流出是植物的應激反應。

植物對重金屬的排斥包括分泌化合物降低有效性、回避攝入、限制運輸和排出體外[36]，研究者們通過NMT研究植物對重金屬的吸收機制。Ma等研究發現，有硅培養的細胞與無硅培養的細胞相比，凈Cd2+內流顯著減少[37]。因為細胞壁中64%的硅在細胞壁分離后與半纖維素成分結合，從而抑制了鎘的吸收。有硅培養的細胞壁表面電位的異質性高于無硅培養的細胞壁表面電位的異質性，且在添加鎘后均質化。


4、問題與展望

由于全球氣候變化加劇，鹽堿化、干旱、洪澇、低溫、高溫等環境問題愈發嚴重，對植物的生存生長不利。多數植物通過調節自身生理機能對逆境有不同的抵抗機制，在生理調節過程中往往伴隨著H+、Ca2+、K+、Cl-、Na+、H2O2等離子/分子流入或流出植物體的過程，通過NMT進行離子/分子流的研究能夠從全新角度闡述植物的抗逆機制，獲得常規方法難以獲得的全新發現[4]。NMT直接在根、葉片細胞等活體植物樣品上，在不損傷細胞膜的情況下獲得離子/分子流速，不僅能夠研究植物抵抗逆境的生理生化反應、微觀上基因調控的機制，還能夠通過對植物耐性機制的研究，篩選具備優良性狀的生物品種。但非損傷微測技術在植物抗性研究方面也存在不足，多數植物都具有抵抗逆境的能力，所能獲得的植物材料有很多，檢測的離子或分子也多種多樣，不同的離子/分子流速在不同的植物材料中有不同的變化趨勢，但建立抗性辨識模型的比較少，沒有具體的評價指標。目前的研究大多僅是單方面采用NMT在植物某一生長時期進行離子或分子流速的測定，而研究植物的長期演化過程是動態連續的，各要素間存在復雜的互作關系，須要將NMT應用于植物整個生命周期的不同發育階段的研究中[4]。

非損傷微測技術在理論研究和試驗實踐中，研究不斷深入，探測范圍不斷擴大，技術不斷完善，非損傷微測技術必將更準確、更全面地揭示植物體離子跨膜運動與植物生理功能之間的關系[2]。關于非損傷微測技術本身的改進，可以增加可檢測的離子/分子種類，探究植物體生命活動規律中不同離子/分子所起的作用，發現更多植物特定的離子/分子流速的變化趨勢，形成特征性圖譜。隨著可檢測的離子/分子種類增多，非損傷微測技術須加快技術革新，每次單一測定一種離子/分子已經不能滿足要求，須要發展多通道離子檢測技術，更便捷地同時測定多種離子/分子，有效發揮實時、活體測定離子/分子的優勢。對于該技術的應用技巧方面，完整活體植株固定在操作平臺上測定時根系易晃動，使用濾紙和小瓷片壓住樣品根系;植物材料相同品種間根系活力差異較大，在準備樣品時選擇較為強盛的根系，并多做平行試驗;儀器反應太靈敏，容易產生基線漂移，須在測定同種離子流不同品種時進行多次校準;試驗環境要求較高，由于樣品容易晃動，數據容易受環境影響而產生波動。還須進一步改進試驗條件。非損傷微測技術也應與其他先進檢測技術結合研究，如熒光顯微、分子生物學、微域分析等，從不同層次不同角度全方位揭示植物的生理生化過程，逐步完善植物長期演化過程的應用研究體系。拓展非損傷微測技術的應用領域需要豐富樣品的品種、類型以及不同的測試部位，如微管形成層、木質部等。同時新的逆境條件出現在不斷出現，如納米物質、病蟲害等，了解植物在新逆境條件下的適應性與植物的生理生化機制，從而推廣非損傷微測技術在植物抗逆以及各領域研究中的應用。

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