【摘要】：細胞是生物體結構和功能的基本單元。分析單個細胞內的基因、小分子和蛋白質等，有助于了解細胞的新陳代謝、信號傳導等現象，對揭示生命活動規律及腫瘤疾病的早期診斷、預防和治療具有重要意義。因此，建立簡單、靈敏、快速檢測單細胞中基因、小分子等物質的檢測成為生命分析領域重要的研究課題。目前用于單細胞分析的技術和方法有顯微分析及顯微操作技術、流式細胞術、熒光分析技術、光鑷技術、活細胞探針、數字成像技術及其相關聯用技術，并且發展迅速。


一些傳統的方法或存在取樣體積大、分析時間長及靈敏度低等缺點，難以適用于單細胞的分析，且獲取單個細胞中生物分子化學信息的檢測方法有限。電化學方法因其設備簡單，不需要使用探針對目標進行標記，很大程度上減小了對細胞正常生理機能的擾動。同時，由于收集電化學信號無需受到光學衍射極限的限制，單細胞電化學分析方法不需要以時間分辨率為代價實現高空間分辨率。制備微電極能力以及納米電化學理論快速發展，顯著提高了電化學測量的檢測極限、特異性和分辨率。因此，電化學分析方法成為正在迅速發展的單細胞分析方法。本論文的研究目的是制備新型的金微電極電化學生物傳感器，建立對TP53基因的檢測及亞細胞水平上ATP的波動連續監測的電化學新方法。主要研究內容如下:1.TP53基因是重要的抑癌基因之一。TP53基因檢測方法對腫瘤疾病的早期診斷和預后具有重要意義。


本研究了基于金微電極檢測TP53基因的電化學傳感新方法。首先制備了尖端直徑分別為220 nm、120 nm、80 nm的3種金微電極，對微電極進行了電化學方法的表征。后將3′端修飾巰基、5′端標記有電活性物質二茂鐵(Fc)的TP53基因捕獲探針通過巰基自組裝作用固定到金微電極表面，制備了可用于檢測目標TP53基因的電化學傳感器。當不存在目標TP53基因時，Fc遠離電極表面，電流信號較小;當檢測到目標TP53基因時，電極上固定的單鏈TP53基因捕獲探針與目標TP53基因雜交形成雙鏈DNA，Fc靠近電極表面，電流信號增大。目標TP53基因的檢出限為0.064 nmol/L。利用該傳感器對細胞提取液中的目標TP53基因進行了檢測，同時對人血清中目標TP53基因進行了加標回收測定。


結果表明，所制備的電化學生物傳感器可用于目標TP53基因的檢測。2.在亞細胞水平上監測三磷酸腺苷(ATP)的變化對研究細胞能量代謝具有重要意義。然而，傳統的ATP檢測方法很難提供細胞不同區域ATP水平差異的信息。本研究建立了單細胞內ATP分布和含量的實時分析方法。采用尖端直徑為120 nm的金微電極為工作電極，將二茂鐵(Fc)標記的ATP適體自組裝到電極表面，制備成用于連續監測亞細胞水平上ATP的波動的電化學傳感器。在目標物質ATP的存在下，ATP適體與兩個ATP結合形成適體-ATP復合物，單鏈適體DNA折疊形成G-四聚體框架結構，Fc與金微電極距離變小，Fc的電子傳遞電流增大，基此對ATP進行定量測定，檢出限為26μmol/L。并利用該電化學傳感器連續監測了饑餓和Ca~(2+)誘導狀態下亞細胞水平ATP的波動變化。