使用離體培養的小鼠的血管紋中間細胞，用記錄離體的中間細胞的膜電位的方法，觀(guān)察順鉑是否能夠影響中間細胞上的離子通道和離子泵。

內淋巴電位及胞外電位的測量

動(dòng)物腹腔注射麻醉劑（氯胺酮90 mg/kg+甲苯噻嗪4.5 mg/kg），麻醉滿(mǎn)意后，在隔音屏蔽室內，將動(dòng)物腹側向上放置于保溫墊上，使其體溫維持于37°C。固定頭部及四肢。頸部正中皮毛備皮。頸部正中切口，手術(shù)顯微鏡下分離皮下組織及肌肉，做氣管切開(kāi)。進(jìn)一步分離頸部肌肉組織，并分離聽(tīng)泡表面附著(zhù)軟組織，暴露聽(tīng)泡。充分止血后開(kāi)放聽(tīng)泡，充分暴露鐙骨動(dòng)脈，耳蝸底轉。

內淋巴電位的記錄方法在以前發(fā)表的文章里已有詳細介紹[16-21]。我們選擇耳蝸底轉來(lái)進(jìn)行內淋巴電位測量。玻璃微電極（直徑為1μm，輸入阻抗10-20 MΩ）固定于微操縱器上，電極內充滿(mǎn)150 mM KCl溶液。參考銀球電極埋入同側頸部肌肉內。使用微操縱器將玻璃微電極由圓窗插入,緩緩推進(jìn)，電極與耳蝸表面接觸時(shí)調整記錄信號的基線(xiàn)為零。經(jīng)鼓階通過(guò)穿透基底膜進(jìn)入中階（圖1A)后，觀(guān)察到一個(gè)穩定的直流電位。使用Axopatch 200B放大器(Molecular Probe,Sunnyvale,CA)來(lái)放大電信號（濾過(guò)頻率為1 kHz）。使用16位A/D轉換器進(jìn)行模數轉換。使用pClamp10.0的軟件進(jìn)行信號采集。采樣頻率設定在10 kHz。

通常采用圓窗電極的方法記錄微音電位[18-21]。我們采用插入鼓階中記錄內淋巴電位的微電極記錄胞外電位（即微音電位）。記錄胞外電位時(shí)，我們采用4kHz的短純音，升降時(shí)間為0.1ms，時(shí)程1秒，強度為85dBSPL。聲音由信號發(fā)生器產(chǎn)生，經(jīng)放大后由揚聲器（MF1-S，TDT）給出。在記錄胞外電位時(shí)，用Axopatch 200B放大器放大信號，濾過(guò)頻率為10kHz，采樣頻率為50kHz。

圖1記錄成年小鼠耳蝸EPFig.1 Recording EP from adult mouse cochleaeA:使用微電極通過(guò)耳蝸基底膜記錄內淋巴電位(EP)的示意圖。IHC：內毛細胞；OHCs：外毛細胞。B:從小鼠耳蝸底轉記錄到的內淋巴電位，紅色箭頭所指為電極插入、退出中階的時(shí)間點(diǎn)。C:從小鼠耳蝸底轉記錄到的內淋巴電位和胞外電位。在記錄內淋巴電位過(guò)程中，用4kHz的短純音誘發(fā)胞外電位（即耳蝸微音電位）。放大的胞外電位顯示在圖C的插圖中。

中間細胞培養

將生后5天C57BL/6J小鼠的內耳組織取出，分離出耳蝸中轉、頂轉的血管紋。將分離獲得的血管紋組織放入預先準備好的裝有DMEM的培養皿中，然后鋪平將其放入到培養箱中。兩個(gè)小時(shí)后加入少量胎牛血清使其濃度達到5-10%之間。次日早晨將培養皿中的培養基更換成PVM細胞專(zhuān)用培養基。在培養過(guò)程中，中間細胞會(huì )從血管紋中遷移出來(lái)，培養5-7天后，大部分中間細胞已經(jīng)遷移出血管紋。由于其含有色素，中間細胞非常易于辨認。

使用全細胞膜片鉗記錄細胞靜息電位

使用Olympus BX51WI正置顯微鏡和Axo?patch 200B放大器,來(lái)進(jìn)行全細胞電壓/電流鉗記錄。微電極使用3D的微操縱器來(lái)控制(MHW-3,Narishige,日本)。微電極是使用顯微拉制儀從直徑1.5 mm玻璃管(A-M Systems,Carlsborg公司)拉制而成。記錄電極的電阻為3-4 MΩ,內充的溶液的成分(mM)為150 KCl,2 MgCl2,1 EGTA,10 HEPES,使用KOH將pH調節到7.3。全細胞膜片鉗建立好后,整個(gè)通路的串聯(lián)電阻為8-12 MΩ。