摘要


功能化基團通常附著在單壁碳納米管（SWNT）的表面，以改善其突出的特性，從而獲得更廣泛的應用。然而，羥基修飾的單壁碳納米管對反硝化微生物的潛在影響尚不清楚。在本研究中，通過使用脫氮副球菌作為模型反硝化微生物，研究了單壁碳納米管OH對反硝化的影響。與原始單壁碳納米管相比，50mg/L單壁碳管OH的存在顯著降低了反硝化效率，從99.3%降至75.0%。機制研究表明，單壁碳納米管OH抑制了負責糖酵解的關鍵酶，這是由于分散性的增加、與酶蛋白的結合電位、與膜相互作用的可能性以及活性氧物種的產生。因此，反硝化細菌利用碳源（葡萄糖）的代謝受到嚴重干擾，隨后細菌的生長和反硝化電子供體（NADH）的生成下降。進一步的研究表明，單壁碳納米管OH還降低了硝酸還原酶的活性。單壁碳納米管OH釋放到環境中可能會對生物圈中的氮循環造成嚴重干擾。

1.導言


在過去幾十年中，大量具有特定物理化學特性的工程納米材料已經制造出來，這些納米材料的各種應用正在開發[1-3]。在各種納米材料中，單壁碳納米管（SWNT）是一種具有單層石墨烯的圓柱形碳納米材料，自1991年首次發現以來已經流行了近二十年[4]。單壁碳納米管的特殊結構決定了其特殊的電氣、化學、機械和熱特性，這使得其在許多領域的潛在應用不斷增長，如復合材料科學、電子學、水凈化和生物技術[5,6]。通常，由于碳納米管之間存在強烈的范德華相互作用，碳納米管的溶解性和分散性較差[7]。為了改善其性能以滿足所需的應用，表面官能團連接到單壁碳納米管是普遍的。到目前為止，大量的無機或有機基團，甚至生物分子（如牛血清白蛋白）附著到單壁碳納米管的表面，以實現特殊目的[5]。在官能化碳納米管中，具有羥基官能團的單壁碳納米管（SWNT-OH）因其改善的生物、機械和其他性能而被廣泛應用[8]。


隨著與碳納米管相關產品的制造和應用的增加，越來越多的單壁碳納米管將被釋放到環境中[9]。釋放的單壁碳納米管可能會影響環境微生物的活性。在文獻中，大量研究集中于碳納米管對模型微生物（如大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌）活力喪失的毒性作用[10-12]。此外，碳納米管對環境中微生物的影響也引起了更多的關注。例如，發現碳納米管的暴露會導致功能喪失，并對污泥、水生沉積物和土壤中的微生物群落產生影響[13–16]。此外，據報道，細菌土壤群落受到單壁碳納米管的影響，這可能干擾土壤中的養分循環[17]。Shrestha等人發現，參與氮、碳和磷循環的酶的代謝活性受到多壁碳納米管的影響[18]。由于碳納米管對環境過程的負面影響，應研究原始和功能化碳納米管對氮循環的影響，因為單壁碳納米管的毒性受到官能團的強烈影響[19]。


氮是存在于土壤、大氣和生物體中的重要元素，氮循環是生物圈中的基本生物地球化學過程之一。在氮循環中，各種化學形式的氮之間的轉換與氣候變化、土壤肥力和水質具有重要相關性。在氮循環的復雜步驟中，反硝化是將氮從硝酸鹽轉化為氣態氮以維持氮平衡的唯一途徑，該過程可能導致水生和土壤系統中氮的損失，并伴隨產生一氧化二氮（N2O），這是一種溫室氣體。因此，對反硝化的任何負面影響都將打破氮平衡，干擾全球氣候[20,21]。


據報道，反硝化作用會受到多種環境污染物的干擾，如重金屬和工程納米顆粒[22–26]。例如，文獻中觀察到氧化物納米顆粒（如ZnO、SiO2和Al2O3納米顆粒）抑制活性污泥中的反硝化還原酶，這進一步導致更多硝酸鹽積累[24–26]。此外，據報道，stutzeri假單胞菌的反硝化過程受到量子點的負面影響[23]。眾所周知，反硝化過程包含一系列的氧化還原反應，其中硝酸鹽通過獲取電子逐步還原，因此反硝化主要依賴于電子轉移。在電子轉移鏈中，煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）和還原煙酰胺腺苷酸二核苷酸（NADH）的轉化在碳源代謝和反硝化過程之間起著至關重要的作用[27]。此外，許多關鍵酶參與碳源代謝和反硝化反應。酶和NADH都是生物大分子，據報道，單壁碳納米管與某些大分子（如蛋白質和膠原）相互作用[28,29]。因此，有必要研究單壁碳納米管對反硝化細菌代謝和功能的影響，特別是從酶活性方面。


本研究以脫氮副球菌為模型反硝化微生物，研究了單壁碳納米管OH對反硝化的影響。此外，從細胞膜完整性、氧化應激反應、減少發電量、細胞增殖以及參與糖酵解和反硝化反應的關鍵酶的活性等方面探討了單壁碳納米管OH顯著抑制反硝化過程和碳源代謝的潛在機制。


2.材料和方法


2.1.反硝化細菌


P、從ATCC購買的反硝化菌（ATCC 19367）被選為測試細菌，因為它廣泛存在于水生和土壤環境中，并且反硝化代謝已得到充分了解[27]。在暴露實驗之前，將微生物在30°C的Difco營養肉湯中，在振動篩中進行有氧培養，持續攪拌（200 rpm）過夜。培養24小時后，根據我們先前的出版物[30]，在早期穩定生長階段收獲細胞。簡而言之，通過在5000 rpm下離心10分鐘收獲細胞，用0.1 M PBS緩沖液（pH 7.4）洗滌3次，然后再懸浮在同一緩沖液中。


2.2.單壁碳納米管和單壁碳管OH本體溶液的制備


單壁碳納米管和單壁碳管OH購自中國南京XF納米科技港口有限公司，單壁碳鋼管OH由制造商從原始單壁碳氮管氧化而成。對于暴露實驗，根據文獻[31]處理單壁碳納米管和單壁碳管OH。將納米管置于12 M HCl溶液中8小時以除去殘留的金屬催化劑，用大量Milli-Q水洗滌至中性pH，然后在烘箱（60°C）中干燥過夜，以獲得粉末狀單壁碳納米管和單壁碳管OH。在接下來的暴露實驗之前，將0.025g制備的粉末狀碳納米管添加到50 mL Milli-Q水中，并將原料懸浮液（500 mg/L）超聲處理1小時（25°C，250 W，40 kHz）。


2.3.單壁碳納米管和單壁碳管OH的表征


通過透射電子顯微鏡（TEM）技術確定了單壁碳納米管和單壁碳管OH的形態和尺寸，并使用FEI-Titan FEG-TEM收集圖像。簡言之，碳納米管粉末在乙醇中充分分散，一滴懸浮液放置在銅網格上。然后，讓網格在成像之前干燥。使用Brunauer–Emmett–Teller（BET）方法測量了單壁碳納米管和單壁碳管OH的比表面積（SSA），數據分別為280和244m2/g。在Mastersize 3000（英國馬爾文）中，通過動態光散射（DLS）測量了單壁碳納米管和單壁碳管OH的直徑分布，并通過Zetasizer Nano ZS 90（英國馬爾溫）測定了zeta電位。


使用Jobin Yvon XploRA fdu激光拉曼分光光度計獲得了單壁碳納米管和單壁碳管OH的拉曼光譜，入射波長為532nm。單壁碳納米管和單壁碳管OH的拉曼光譜分別在1342和1583cm1處顯示D帶和G帶。對于每個樣品，繪制光譜曲線，并在G帶歸一化后計算ID/IG。


通過X射線光電子能譜（XPS）測定元素組成和表面官能化百分比。從PHI 5000C ESCA系統（Perkin–Elmer）中收集數據，Mg目標壓力為14.0 kV，功率為300 W。單壁碳納米管和單壁碳管OH樣品均采集0–1200 eV全掃描光譜（通過能量為93.9 eV），然后收集相關元素以獲得窄軌掃描光譜。最終結果由AugerScan 3.21軟件分析，C1s=284.6eV作為結合校正的基準。


通過熱重分析（TGA）研究了酸處理前后催化劑殘留量的變化。數據由Discovery TGA收集，溫度范圍為200–1000℃，上升速率為10°C/min，在流動空氣中。質量損失百分比和質量速率曲線顯示了酸預處理的成功，并對每毫克樣品的曲線進行了歸一化。


2.4.暴露于單壁碳納米管和單壁碳管OH的反硝化細菌的實驗


在這項研究中，反硝化細菌暴露于0、10和50mg/L的碳納米管中。暴露實驗在含有礦物質培養基的血清瓶中進行。礦物培養基根據參考標準制備，稍加修改（g/L）：葡萄糖，5.0；K2HPO4，7.0；KH2PO4，3.0；檸檬酸鈉2H2O，0.5；MgSO47H2O，0.1；（NH4）SO4，1.0；KNO3、2.16和50微升/升的微量元素溶液[32]。所含微量元素（g/L）：CaCl22H2O，7.4；MnSO4H2O，1.0；ZnSO47H2O，3.6；CoCl26H2O，0.4；FeCl36H2O，0.96；CuCl22H2O，0.03；H3BO3，0.3；NiCl26H2O，0.01；EDTA-Na2，3.7。初始硝酸鹽濃度為300mg NO3-N/L。根據文獻[23]，硫酸銨用于阻止同化硝酸鹽的還原，并確保硝酸鹽的消耗是由呼吸引起的。對所有瓶子和相關設備進行消毒，然后用紫外線消毒20分鐘。添加單壁碳納米管或單壁碳管OH散裝溶液后，添加細菌懸浮液，以確保每個瓶子的初始OD600值為0.05。將氬氣吹掃到每個瓶子中10分鐘，以確保厭氧條件。密封后，將所有瓶子放置在恒溫30°C的搖床（200 rpm）中。


細胞生長由光密度OD600值確定，該值在曝光實驗期間每4小時測量一次。由于碳納米管在600nm處的光吸收，OD測量中用于校正背景的空白是添加了單壁碳納米管或單壁碳管OH的礦物介質。減去碳納米管空白后，通過繪制OD600數據與時間的對比圖生成OD生長曲線[33,34]。


培養基中NO3、NO2和N2O的濃度每隔4小時測量一次，總時間為24小時。NO3和NO2的測量由分光光度計根據標準方法進行[35]。反硝化梭菌產生的N2O由帶有電子捕獲檢測器（ECD）的氣相色譜儀（GC）（安捷倫7820A，美國）測定。直接對氣體中的N2O進行采樣，并通過注射器將其注入GC的樣品入口，在平衡溫度和時間分別為25°C和3小時的頂空下檢測水溶液中的N2O[36]。


2.5.暴露于SWNT和SWNT OH的反硝化細菌對葡萄糖的利用


測量了暴露于單壁碳納米管和單壁碳管OH的反硝化梭菌對葡萄糖的利用率，該方法符合先前的出版物[37]。為了消除葡萄糖吸附在碳納米管上造成的偏差，通過減去碳納米管吸附的葡萄糖來計算消耗的葡萄糖濃度。如下檢測單壁碳納米管和單壁碳管OH（10和50mg/L）對葡萄糖的吸附。除不添加反硝化細菌外，具體程序與暴露試驗相同。獲得樣品并以12000 rpm（5分鐘）離心，上清液用于測試剩余葡萄糖濃度。碳納米管吸附的葡萄糖是初始葡萄糖和剩余葡萄糖濃度之間的差異。


2.6.酶活性的測定


暴露24小時后，制備粗細胞提取物用于酶活性測定。通過以5000rpm離心10分鐘收獲細胞，用100mM PBS（pH 7.4）洗滌兩次，然后再懸浮在相同的緩沖液中。通過在20 kHz下超聲處理5分鐘來破壞懸浮液5分鐘，然后通過在12000 rpm下離心10分鐘來去除細胞碎片。上述操作在4°C下進行。粗細胞提取物立即用于測定特定酶活性，細胞提取物中的蛋白質含量通過Lowry等人的方法測定，以牛血清白蛋白為標準[38]。酶活性被定義為每分鐘每毫克蛋白質的轉化底物量（以1mol min1 mg#1表示），這表明酶活性是基于相同的蛋白質含量進行比較的。


己糖激酶（HK）、6-磷酸果糖激酶（PFK）和丙酮酸激酶（PK）活性的測定根據文獻[39]進行。甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）活性通過從Sciencell Research Laboratories（美國）購買的檢測試劑盒進行測量。首先，根據文獻或說明書制備分析混合物以供后續使用。然后，加入50ll細胞提取物以開始反應，并每30秒記錄340nm處的吸光度，持續3分鐘。特定酶活性測定為吸光度變化梯度除以蛋白質含量。


關鍵反硝化酶（包括硝酸還原酶（NAR）、亞硝酸鹽還原酶、一氧化氮還原酶和一氧化二氮還原酶）的活性測定根據我們之前的出版物[30]進行。簡而言之，測定混合物包含10mM PBS緩沖液（pH 7.4）、1mM甲基紫精、5mM Na2S2O4和1mM反應電子受體（KNO3、NaNO2、NO或N2O）。所有上述物質均從儲備溶液或飽和溶液（如NO和N2O）中稀釋。飽和溶液（NO為2.0 mM，N2O為25 mM）是通過連續5分鐘將純NO或N2O氣體吹掃到Milli-Q水中來制備的。應注意的是，有關NO的所有操作都是在厭氧環境下進行的，或者NO的Ar保護很容易被氧氧化[40]。通過向測定混合物中加入0.3 mL粗細胞提取物開始反應。然后立即將混合物放置在30°C培養箱中，每10分鐘收集一次數據。具體而言，通過分光光度計檢測亞硝酸鹽濃度的增加或減少，以進行NAR和NIR測量，并通過NOR和N2OR的相應微傳感器（丹麥Unisense）記錄混合物中一氧化氮或一氧化二氮的消耗量。NAR和NIR的活性分別表示為lmol亞硝酸鹽/（min-mg蛋白）的產生和減少；對于NOR和N2OR，酶活性的單位分別為1mol一氧化氮/（min-mg蛋白質）和lmol氧化亞氮/（min-mg蛋白質）的消耗量。


2.7.NAD+和NADH測定


詳細程序根據文獻[41]進行。將重復樣品（各1ml，一個用于NAD+測量，另一個用于NADH測量）在12000 rpm下離心5分鐘。然后去除上清液，并添加300 lL 0.2 M HCl（用于NAD+提?。┗?.2 M NaOH（用于NADH提?。┮灾匦聭腋☆w粒。將樣品置于50℃水浴中10分鐘，然后用冰冷卻至0℃。通過在旋轉的同時滴加300升0.1 M NaOH（用于NAD+提?。┗?00升0.1 M HCl（用于NADH提?。﹣碇泻吞崛∥?。通過在15000 rpm下離心5分鐘除去細胞碎片。立即將上清液轉移到新試管中進行測量。


通過酶循環測定法測定細胞內NADH和NAD+濃度。循環試驗混合物由等體積的1.0 mM Bicine緩沖液（pH 8.0）、乙醇、40 mM EDTA（pH 8.0）、4.2 mM噻唑藍（MTT）和兩倍體積的16.6 mM乙醇硫酸吩嗪（PES）組成，然后在30°C下孵育10分鐘。反應混合物的制備如下：50 lL中和細胞提取物、0.3 mL蒸餾水和0.6 mL試劑混合物。通過加入50ll乙醇脫氫酶（ADH，500U/mL）開始反應。在30℃下每30秒檢查570 nm處的吸光度10分鐘。NADH和NAD+的濃度用0.01–0.05mM NADH與NAD+標準溶液校準。最終的NAD+與NADH水平按毫克蛋白質計算。


2.8.反硝化梭菌的細胞膜完整性和活性氧產生


根據制造商的說明，使用細胞毒性檢測試劑盒（羅氏應用科學公司）測量乳酸脫氫酶（LDH）釋放，以研究反硝化梭菌的細胞膜完整性。暴露于SWNT和SWNT OH后，制備培養上清液并將其接種在96孔板上，然后添加50 lL底物混合物（羅氏應用科學）。然后，在室溫下孵育30分鐘后加入50 lL stop溶液（羅氏應用科學公司），并使用微孔板讀取器（BioTek，USA）在490 nm吸光度下獲得數據。根據先前的出版物[24]，通過掃描電子顯微鏡（SEM）圖像分析了反硝化細菌暴露于單壁碳納米管或單壁碳管OH后的表面形態。


碳納米管誘導的細胞內活性氧（ROS）產生通過熒光分析測定[42]。培養24小時后，通過5000 rpm離心5分鐘收集細菌，然后用0.1M磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）洗滌三次。將顆粒重新懸浮在含有50lm二氯二氫熒光素二乙酸酯（H2DCF-DA，分子探針，Invitrogen）的0.1M磷酸鹽緩沖液（PBS）中，并在30°C厭氧培養箱中黑暗中放置30分鐘。通過離心除去PBS后，將細菌重新懸浮在包含濃度分別為0、10和50mg/L的SWNT或SWNT OH的礦物培養基中，然后在厭氧條件下在96孔板中孵育24小時，然后用485nm激發和520nm發射濾光器由微孔板讀取器（BioTek，USA）檢測。


2.9.統計分析


所有試驗一式三份，結果以平均值±標準偏差表示。方差分析（ANOVA）用于檢驗結果的顯著性，p<0.05被認為具有統計學意義。


3.結果和討論


3.1.單壁碳納米管與單壁碳管OH之間影響脫氮性能的比較


碳納米管的環境行為和毒性取決于尺寸、純度、表面積和表面化學等性質[43]。在暴露實驗之前，本研究采用了幾種表征方法，以提供單壁碳納米管和單壁碳管OH的準確信息。圖1a和b顯示了單壁碳納米管和單壁碳管OH的TEM圖像，單管直徑在3-5nm范圍內。在圖1c中，通過XPS光譜提供了單壁碳納米管和單壁碳管OH的元素組成，結果表明，單壁碳管OH的氧含量（6.53%）高于單壁碳氮管（0.57%），這表明單壁碳核管OH表面存在羥基。此外，拉曼光譜顯示在圖1d中，G帶歸一化后顯示D帶和G帶。這些譜帶的強度比（ID/IG）表明了功能化程度，更高的ID/IG比意味著CNT表面的共價功能化程度更高[44]。在本研究中，單壁碳納米管和單壁碳管OH的ID/IG比分別為0.09和0.30，這證明了單壁碳氮管OH上存在共價官能團。為了測定碳納米管中的殘余金屬含量，采用TGA分析獲得圖1e中的質量損失曲線。一般而言，當碳納米管樣品加熱至600°C或更高溫度時，含碳成分被去除，剩余質量包含催化金屬及其氧化。從TGA曲線來看，酸處理后的單壁碳納米管殘留質量百分比較低，表明酸處理成功去除了金屬催化劑。

圖1.通過各種技術對單壁碳納米管和單壁碳管OH樣品的表征。（a）單壁碳納米管的TEM圖像；（b）單壁碳納米管OH的TEM圖像；（c）SWNTs和SWNTs OH的XPS光譜（534eV是氧元素的對應位置）。（d）G-帶歸一化后的單壁碳納米管和單壁碳管OH的拉曼光譜。（e）酸處理前后單壁碳納米管的熱重分析以及最終穩定質量百分比是由于金屬催化劑的存在。


暴露24小時后，如圖2a所示，對照組以及10和50 mg/L單壁碳納米管試驗中的NO3-N濃度分別為3.1、3.8和3.0 mg/L，相應的硝酸鹽去除效率分別為99.0%、98.7%和99.0%，這表明10或50 mg/L單壁碳管的存在對脫氮沒有顯著影響（p>0.05）。然而，當細胞暴露于10mg/L的單壁碳納米管OH時，最終硝酸鹽濃度為44.5mg/L，NO3-N去除效率降低至85.2%。進一步增加單壁碳納米管OH至50 mg/L會導致反硝化性能大大降低，最終NO3 N濃度和去除效率分別為74.9 mg/L和75.0%。因此，在本研究所研究的劑量下，羥基官能化單壁碳納米管抑制了反硝化細菌的硝酸鹽還原過程。然而，從圖2b中可以看出，在添加單壁碳納米管或單壁碳管OH后，亞硝酸鹽和一氧化二氮的變化接近于對照，并且在暴露24小時后，所有實驗中的最終亞硝酸鹽與一氧化二氫幾乎相同（接近零）。單壁碳納米管或單壁碳管OH的存在似乎沒有干擾反硝化過程中亞硝酸鹽和一氧化二氮的生物還原反應。在下文中，研究了單壁碳納米管OH抑制反硝化細菌硝酸鹽還原的機理。

圖2.在24小時暴露試驗期間，單壁碳納米管和單壁碳管OH對NO3-N（固體，a）、NO2-N（空心，a）和N2O（b）變化的影響。誤差條表示三次測量的標準偏差。


3.2.單壁碳納米管OH影響反硝化細菌脫氮的機理


通常，由于高比表面積和生物活性，納米材料很可能附著到細胞表面，細胞與納米材料之間的物理接觸已經得到證實[45]。在此，圖3顯示了反硝化梭菌在與50mg/L的單壁碳納米管或單壁碳管OH接觸24小時后的細胞形態的SEM圖像?？梢钥闯?，單壁碳氮納米管和單壁碳T OH附著在球形反硝化梭魚的表面上。與對照組相比，暴露于SWNT和SWNT OH的細胞仍保持完整的形態。文獻中使用LDH釋放分析來研究納米材料對細胞結構完整性的影響[24]，結果（圖4）表明，在不存在和存在碳納米管的情況下，LDH釋放沒有顯著差異（p>0.05）。因此，10或50 mg/L的單壁碳納米管或單壁碳管OH的存在不會引起反硝化梭菌細胞膜的損傷和細胞質的滲漏。



圖3.反硝化梭菌暴露于0（a）和50 mg/L單壁碳納米管（b）和單壁碳管OH（c）24小時的SEM圖像。

圖4.反硝化梭菌在與單壁碳納米管或單壁碳氮納米管接觸24小時后的乳酸脫氫酶釋放。誤差條表示三次測量的標準偏差。統計分析表明，對照組與單壁碳納米管或單壁碳管OH添加之間的差異不顯著（p>0.05）。


即使細胞結構沒有被單壁碳納米管或單壁碳管OH破壞，但仍不清楚是否會影響細菌的代謝。本研究采用葡萄糖作為碳源，初始濃度為5g/L。作為優秀的吸收劑，碳納米管將吸附培養基中的有機分子，這應在毒性試驗中予以考慮[46]。在培養基中，對于10mg/L單壁碳納米管、50mg/L單體碳納米管、10mg/L單壁碳管OH和50mg/L單體碳管OH，吸附部分與總葡萄糖的比率分別為1.22%、2.67%、1.07%和2.42%，因此吸附的葡萄糖占總葡萄糖的很小部分。在用單壁碳納米管和單壁碳管OH減去吸附的葡萄糖后，計算反硝化細菌利用的葡萄糖，如圖5b所示。培養24小時后，在10或50 mg/L原始單壁碳納米管存在下的利用葡萄糖濃度幾乎與對照相同。然而，當暴露于10mg/L的單壁碳納米管OH時，反硝化梭菌對葡萄糖的利用較少，這表明單壁碳管OH抑制了葡萄糖的利用。根據圖5b，當單壁碳納米管OH的劑量為50mg/L時，抑制效果進一步增強。

圖5.葡萄糖轉化途徑的示意圖（a），以及單壁碳納米管和單壁碳管OH暴露24小時對利用葡萄糖濃度（b）、參與糖酵解的關鍵酶的相對活性（c）和細胞內NADH/NAD+比率（d）的影響。誤差條表示三次測量的標準偏差。


為了找出單壁碳納米管OH抑制葡萄糖利用的原因，研究了一些參與葡萄糖代謝的關鍵酶。葡萄糖在細菌中的代謝（即糖酵解）是一個復雜的過程，具體轉化如圖5a所示。甘油醛磷酸脫氫酶（GAPDH）是催化甘油醛3-磷酸酯（G-3-P）轉化為1,3-二磷酸甘油酯（1,3-BPG）的重要酶，是葡萄糖Embden-Meyerhof途徑中生成NADH的唯一步驟。據報道，GAPDH的比活性受到環境因素的負面影響，如碳源、重金屬離子和氧化應激，這可能導致糖酵解活性降低[47–49]。圖5c表明，10 mg/L和50 mg/L的單壁碳納米管OH處理引起的GAPDH活性分別為對照的72.0%和43.8%，這表明單壁碳管OH誘導了GAPDH的失活，并且隨著單壁碳氮納米管OH劑量的增加，副作用增大。此外，葡萄糖轉化途徑中存在三種不可逆反應，三種激酶（即己糖激酶（HK）、6-磷酸果糖激酶（PFK）和丙酮酸激酶（PK））在這些步驟中起著至關重要的作用。激酶是一種將磷酸基團從高能供體分子轉移到特定底物的重要酶，負責細菌生長和代謝過程中的能量轉換和產生。從圖5c中的數據可以看出，單壁碳納米管（10或50 mg/L）的暴露不會導致這些酶活性的顯著損失（p>0.05）。然而，在10或50 mg/L單壁碳納米管OH存在下，HK、PFK和PK的活性顯著降低。例如，在50 mg/L單壁碳管OH暴露試驗中，這些酶分別降低到對照的80%、72%和78%。對這些關鍵酶的抑制阻礙了糖酵解過程，因此，羥基官能化單壁碳納米管的存在降低了葡萄糖的利用率。葡萄糖的利用是一個重要的生物過程，在能量代謝中起著重要作用。當細胞暴露于富勒烯衍生物（另一種碳基納米材料）時，葡萄糖呼吸受到抑制，這解釋了富勒烯對[50]的抑菌作用。此外，Kang等人研究了碳納米管對大腸桿菌的抗菌作用，DNA微陣列數據表明與糖酵解相關的基因受碳納米管調控[51]，這從基因水平證實了碳納米管對于葡萄糖代謝的影響。


上述結果表明，單壁碳納米管表面的共價羥基導致對糖酵解的抑制。羥基官能化可以改變碳納米管的表面結構，進而影響其物理化學性質。下文從單壁碳納米管的親水性、氧化應力和羥基化后的極性表面能等方面闡明了原因。首先，親水基團修飾的碳納米管可以通過脂質輔助機制很容易與生物膜相互作用[52]。因此，與原始單壁碳納米管相比，由親水性極性基團羥基修飾的單壁碳管更容易與微生物相互作用。其次，活性氧生成過多被認為是單壁碳納米管細胞毒性的一個重要原因[53]，活性氧的增加可能會抑制細胞能量產生過程（如糖酵解）[47]。在本研究中，反硝化梭菌暴露于單壁碳納米管OH時產生更多的活性氧（見SD，圖S1）。因此，由于ROS的產生，暴露于單壁碳納米管OH時觀察到葡萄糖利用率較低。此外，據報道，碳納米管的羥基官能化顯示出極性表面能的差異，并具有與基質化合物（如蛋白質）交聯的更大潛力[54]，這將使蛋白質變性。眾所周知，反硝化梭菌中存在許多酶，它們在細胞內代謝，特別是葡萄糖同化過程中發揮著重要作用。因此，負責糖酵解的酶很可能被單壁碳納米管OH變性，這將干擾葡萄糖的利用。


碳源（即本研究中的葡萄糖）的代謝在反硝化微生物中起著重要作用，如電子轉移鏈的運行和細菌的生長。P、反硝化菌利用有效而復雜的電子轉移鏈實現細胞質、周質和膜的整個代謝[55]。高價氮化合物的還原取決于電子轉移，最重要的電子轉移介質是NAD+和NADH[27]。該輔因子對在微生物分解代謝中起主要作用，其中碳源使用NAD+氧化，并由GAPDH催化生成NADH形式的還原當量（圖5a）。還原NADH和氧化NAD+之間的相互轉化對于維持氧化還原平衡至關重要，NADH/NAD+比率是衡量細菌氧化還原狀態的重要參數[41]。如圖5d所示，10或50 mg/L的單壁碳納米管OH顯著干擾了細胞內NADH/NAD+比率，因為暴露于單壁碳管OH的細菌的NADH/NAD+比例遠低于對照。因此，單壁碳納米管OH的存在導致比對照和單壁碳管更具氧化性的環境，最終導致較低的脫氮效率。


由于單壁碳納米管OH的存在對反硝化梭菌的葡萄糖代謝具有顯著的抑制作用，因此細胞生長也可能受到影響。如圖6所示，在適應階段（0–8小時）后，微生物進入指數階段，暴露于10或50 mg/L單壁碳納米管的細菌顯示出與對照幾乎相同的生長曲線。即使在許多研究中，單壁碳納米管對大腸桿菌和枯草桿菌顯示出強烈的抗菌活性[11,34]，但單壁碳管的毒性行為取決于實驗條件，如細胞類別、培養基組成和其他因素[56]，這一點仍不確定。例如，Arias和Yang發現，不同的介質組成會導致單壁碳納米管對細菌的毒性表現不同[57]。因此，與其他研究不同，原始單壁碳納米管在反硝化介質中沒有顯示出明顯的毒性。在本研究中，對照試驗的最終OD600值為1.461，在10 mg/L和50 mg/L單壁碳納米管暴露試驗中分別為1.458和1.470。然而，在10 mg/L和50 mg/L單壁碳納米管OH存在下，最終OD600數據分別降至1.330和1.169。顯然，單壁碳納米管OH顯著干擾了反硝化梭菌的生長，而原始單壁碳管不影響細胞生長。

圖6.單壁碳納米管和單壁碳管OH對反硝化細菌生長曲線的影響。誤差條表示三次測量的標準偏差。


Pasquini等人發現，羥基化單壁碳納米管比原始單壁碳管對大腸桿菌的細胞毒性更嚴重，因為羥基功能化誘導了更好的分散性和更小的尺寸，這歸因于毒性的提高[31]。此外，在我們的研究中，單壁碳納米管OH表現出比單壁碳管更穩定的狀態和分散性，因為它們的zeta電位更負（圖S2，SD）。更好的分散性意味著形成碳納米管束的可能性更小，這導致觀察到的尺寸更小。在本研究中，DLS分析表明，羥基化單壁碳納米管的水力直徑僅為介質中原始單壁碳管的64.2%。因此，羥基化碳納米管由于更好的分散特性，導致對反硝化細菌的毒性升高。


在反硝化過程中，幾個關鍵酶，如硝酸還原酶、亞硝酸鹽還原酶，一氧化氮還原酶和氧化亞氮還原酶分別催化硝酸鹽還原為亞硝酸鹽、亞硝酸鈉還原為一氧化氮、氧化亞氮還原為氧化亞氮和氧化亞鐵還原為氮。在我們之前的研究中，觀察到氧化物納米材料抑制了活性污泥中反硝化酶的活性[24–26]。如圖7所示，與對照相比，單壁碳納米管OH降低了硝酸還原酶（NAR）的比活性（p<0.05），但其他三種酶（NIR、NOR和N2OR）的比活度沒有受到干擾（p>0.05）。對于四種反硝化酶，當細菌暴露于單壁碳納米管OH時，觀察到不同的反應，在其他研究中觀察到類似的結果，即納米材料僅抑制NAR的活性，而不是else反硝化酶[24]。顯然，單壁碳納米管OH的存在僅影響硝酸鹽的還原，而對亞硝酸鹽、一氧化氮和一氧化二氮的還原影響不大。這些結果與圖2中的上述觀察結果一致，即單壁碳納米管OH導致反硝化系統中過量的硝酸鹽積累，但亞硝酸鹽和一氧化二氮的生成沒有受到影響。

圖7.在24小時的實驗時間，單壁碳納米管和單壁碳管OH對硝酸還原酶（NAR）、亞硝酸鹽還原酶、一氧化氮還原酶和氧化亞氮還原酶活性的影響。誤差條表示三次測量的標準偏差。


4.結論


綜上所述，由于參與糖酵解的關鍵酶活性較低，單壁碳納米管OH暴露于反硝化梭菌會抑制葡萄糖利用的代謝，從而導致NADH/NAD+比率降低和細胞生長延遲。此外，單壁碳納米管OH削弱了硝酸還原酶的活性。與原始單壁碳納米管相比，單壁碳管OH對反硝化細菌的毒性可能更高，因為分散性增加，與大分子的結合潛力更好，與膜相互作用的機會更大。因此，觀察到羥基官能化單壁碳納米管的存在對反硝化產生負面影響，這將進一步干擾環境中的氮循環。


致謝


這項工作得到了國家自然科學基金（51425802、41301558、51472035和51202020）、上海學科首席科學家項目（15XD1503400）、江蘇省科學技術廳（BY2013024-04和BE2014089）的資助。


附錄A.補充數據


與本文相關的補充數據可在在線版本中找到，網址為：http://dx.doi.org/10.1016/j.cej.2015.05.005.