用于刺激視網膜神經元的電子視網膜假體有望恢復視力。然而，傳統視網膜植入物的剛性電極會對軟視網膜組織造成損害。由于它們與退行性視網膜中的靶細胞的接近程度較差，因此它們的選擇性也有限。


近日，延世大學材料科學與工程系的Jang-Ung Park教授，眼科的Suk Ho Byeon教授以及釜山國立大學有機材料科學與工程系的Seung Geol Lee教授報道了一種柔性人造視網膜，具有直接打印的3D LM微電極，能夠進行微創視網膜刺激。體內實驗表明，可見光照明誘導了光線入射的局部視網膜區域的RGCs的尖峰活動，表明活rd1小鼠具有視力恢復的潛力。這些結果對不均勻視網膜變性患者的個性化人工視網膜的開發具有預后意義。其主要研究方向為以電化學為基礎的柔性可穿戴仿生器件的制備及應用。


相關工作以“Liquid-metal-based three-dimensional microelectrode arrays integrated with implantable ultrathin retinal prosthesis for vision restoration”為題發表在Nature Nanotechnology上。


基本內容


視網膜變形疾病通常會造成感光細胞逐漸喪失或者永久性損傷，從而導致嚴重的視力損害。然而，視網膜內層神經元能夠得以保留，該組織的電激活能夠產生視覺感知（光幻視），這使得制備利用光響應裝置電刺激內層視網膜神經元的電子視網膜假體成為一種有前景的恢復視力的方法。值得注意的是，人類受試者及相關手術表明視網膜和植入物之間的不一致（例如電極與細胞之間的距離，細胞與設備之間的機械適配）是限制該設備成效和應用的主要原因。為了解決這一限制，人們研究了超薄柔性光電器件以將其共形地附著在彎曲的視網膜表面上，但扁平形狀的電極會導致局部凹凸不平的視網膜表面產生幾何間隙。三維（3D）微電極有望有效刺激神經系統，縮短電極與細胞之間的距離。此外，它們可以通過繞過不應被刺激的神經元來刺激選擇性局部區域，從而提供出色的選擇性和高空間分辨率。但是，先前報道的3D神經電極往往利用剛性固態材料，這可能或直接損害柔軟的視網膜或導致視網膜內的炎癥反應。


為了應對這些挑戰，該研究團隊公布了一種軟人造視網膜，將柔性、超薄和光敏晶體管陣列與液態金屬（LMs）的軟3D刺激電極集成在一起，用于視力恢復。其中，低毒性軟共晶鎵銦合金（EGaln）液態金屬被3D打印為具有高分辨率的刺激電極，相對于以前使用的剛性柱狀/尖峰電極材料相比，最大限度地減少了視網膜的不良損傷。此外，局部涂覆在這些EGaln-LM電極尖端上的鉑（Pt）納米團簇能夠有效地將電荷注入視網膜神經元。機器學習應用于動物實驗期間產生的輸出信號，以分析誘發的視網膜神經節（RGC）棘波。并在體內實驗證實了可見光照射引起的信號放大在光入射局部區域的視網膜神經節細胞中引起實時反應，能夠使患有大量感光細胞變性的活視網膜變性（rd1）小鼠恢復視力，有望應用于治療人類視網膜變性相關疾病并促進視力修復。

圖1.采用3D LM微電極陣列的軟人工視網膜。


首先，作者介紹了3DLM微電極陣列軟人工視網膜的結構和體內外生物相容性。該微電極（圖1a）能夠緊鄰不均勻變性視網膜表面，LMs突出的柔軟柱狀探針直接刺激視網膜神經節細胞（RGCs）。從該器件結構的布局來看（圖1b），EGaln微柱陣列通過3D打印直接印刷在光電晶體管的漏電極表面上，柱子側壁被聚對二甲苯C層封裝，頂端電鍍了鉑納米團簇（鉑黑PtB）增加了微電極的納米級粗糙度和它們的電化學表面積。光電晶體管用于產生光電流，增大漏極電流，并在漏極電壓的脈沖刺激下，通過微電極注入RGCs的電荷顯著增加，然后在RGCs內誘發的動作電位傳遞到視神經，從而替代視覺信息。這種人造視網膜結構將高分辨率晶體管陣列和3D LM微電極集成在一起，每個微電極尖端均具有PtB涂層，且這些涂層沒有改變EGlan本身的彈性模量（圖1c-1e）。為了確保該裝置的體內/體外生物相容性，作者使用人視網膜色素上皮細胞的活/死細胞進行了細胞生存能力的測試以及在植入活體rd1小鼠五周后相關免疫和神經毒性的測試，結果表明該裝置滿足醫療器械的體外/體內毒性標準（圖1f-1g）。

圖2.光電晶體管陣列的光電特性和三維LM微電極的電化學特性。


然后，作者表征了該軟性人工視網膜的光電及電化學特性。不同光強度照射下該設備顯示出典型的光敏場效應晶體管行為（圖2a-2b），并且具有較快的光響應和恢復時間（圖2c）。此外，該晶體管陣列與入射光強度呈現線性比例（圖2d）并且允許在光照期間觀察通過鷹形蔭罩圖案的光（圖2e）。為了得到一個柱狀3D LM微電極陣列作為刺激電極，作者使用具有高分辨率打印的3D直接打印系統（圖2f）。其中玻璃毛細管嘴的內徑決定了EGaln柱的直徑，載物臺的縱向下降速度決定支柱的高度（圖2g-2i）。此外，循環伏安曲線表明了該器件的阻抗和電荷存儲容量不隨支柱的高度而顯著變化（圖2j-2k）。

圖3.使用WT和rd1小鼠視網膜的離體實驗。


隨后，作者使用野生型（WT）和rd1小鼠的視網膜探究了該器件的體外電生理作用，包括光、電刺激和電極的影響。先是記錄了它們的視網膜在3D LM微電極上通過視覺或者電誘發時的反應，每個記錄電極與每個刺激電極相鄰放置（圖3a-3b）。將來自WT和rd1小鼠的分離的視網膜放置在該設備上，3D LM微電極朝向視網膜的RGC側。通過在沒有設備操作的光照下記錄了它們的視覺誘發電位（VEPs），而電誘發電位（EEPs）在黑暗狀態下利用設備操作時進行記錄。此外，由于小鼠是只有兩種視錐細胞類型的兩色哺乳動物（對藍光和綠光敏感），因此視覺誘發使用470 nm的藍光。結果顯示光線沒有在rd1小鼠視網膜內引起視網膜反應（圖3c）。而在電誘發實驗中，兩種小鼠的視網膜均出現可比EEP量級的RGC尖峰，而且rd1小鼠比WT型放電活動更早、增強更明顯（圖3d）。已知rd1小鼠視網膜的形態學變化，包括RGC大小和內核層厚度的減少，會影響RGCs的功能特性，導致刺激閾值增加和潛伏期延長。接著作者分別使用平面型電極和具有不同高度的3D LM微電極在不同強度的光照下對兩種視網膜進行設備操作時誘發EEP（圖3e-3i），結果顯示在平面型電極上誘發的RGC荊波放電率和光強度成比例增加（圖3g）。與rd1情況相比，由于正常感光層的天然反應，WT小鼠視網膜顯示出更高的放電率。而盡管柱狀微電極具有與高度無關的電化學特征，但柱狀結構電極在電刺激過程中增加了RGCs的放電活動（圖3j）。且當高度超過90μm時射速再次下降。這可能是由于刺激尖端穿過目標RGCs時誤將RGCs作為目標造成的。

圖4.用無監督機器學習的信號分類。


考慮到視網膜活動的復雜性，作者利用無監督機器學習進行信號處理。根據信號的大小和形狀，給定的數據被分為不同的組（圖4a）。然后，進行了K-均值聚類，將初步分類的信號作為輸入數據。結果顯示視網膜尖峰數據被進一步分類為具有不同潛在價值大小的四個聚類（圖4b）。通過無監督的機器學習來分析這些分類的視網膜尖峰，以獲得具有標準偏差的平均信號。此外，聚類1、2和3的同一聚類內的信號顯示了相似的潛在值形式和時間持續時間（圖4c-e)。當刺激RGC體細胞時，典型的細胞外記錄的尖峰反應顯示膜電位迅速降低（去極化），隨后增加（復極），而RGC軸突顯示相反的尖峰反應。3D LM微電極電刺激后立即記錄的分類RGC信號波形僅呈現亞毫秒去極化的軀體RGC反應。這些結果表明了使用3D LM微電極選擇性刺激RGC體細胞的潛力。盡管軸突刺激無法消除，但這種對RGC體的選擇性刺激有可能減少軸突激活，從而導致更自然的視覺和更少的不規則感知。

圖5.使用活rd1小鼠進行視力恢復的體內實驗。


最后，作者將具有3D LM微電極的人造視網膜裝置植入體內活的rd1小鼠（n=3）中，確認感光層完全簡并后進行活體小鼠的體內視力恢復實驗。適配后的結果顯示該裝置很好地附著在視網膜表面，沒有明顯的損傷或出血（圖5a）。而且，手術后獲得的橫截面光學相干斷層掃描圖像表明，3D LM微電極被視網膜組織共形包圍，而沒有塌陷（圖5b）。作者通過恒定光照下誘發尖峰的電位和發射速率的實時跡線以及在該光照期間對發射速率進行了空間映射。通過與無光照明的情況相比證明了該設備在受刺激的視網膜區域具有良好的均勻性（圖5c-5e）。此外，作者還使用激光通過橢球形圖案的陰影掩膜選擇性地暴露局部區域以驗證退行性視網膜反應，結果顯示光照區域表現出相對較大的視網膜響應（圖5f-5g）。值得注意的是，當RGC軸突受到電刺激時，電刺激會發生逆向傳播，導致黑暗狀態下的錯誤RGC反應。最大發射率（即感受野）的空間分布與這種照明的橢圓形非常相似（圖5h）。而且分類RGC尖峰顯示了與離體結果相似的體細胞RGC反應的典型波形。為了定量比較激光照射和激光非照射區域（即黑暗狀態）的視網膜反應，每個記錄電極（像素）的位置被標記為索引（圖5i）。然后，對全亮像素（指數1-9）和暗態像素（指數16-36）記錄的最大發射率進行平均。完全暴露區域的RGC放射性比本底RGC放射性大約高四倍，充分證明了該器件在體內應用的潛力。


總結


作者報道了一種柔性人造視網膜，具有直接打印的3D LM微電極，能夠進行微創視網膜刺激。體內實驗表明，可見光照明誘導了光線入射的局部視網膜區域的RGCs的尖峰活動，表明活rd1小鼠具有視力恢復的潛力。這些結果對不均勻視網膜變性患者的個性化人工視網膜的開發具有預后意義。


作者還探究了設備尺寸的進一步擴大和像素數量的增加使其能夠應用于具有更大眼球和更厚視網膜的大型動物模型。減小刺激電極尺寸對于實現高分辨率刺激至關重要。作者認為，對納米級材料（例如，Pt納米團簇）的進一步研究，通過在電極表面增加納米級粗糙度來增強刺激效果，可能是一項在未來實現更有效視力恢復的具有重要潛力的工作。